КЛИНИЧЕСКOЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРАПЕПТИДА Ala-Glu-Asp-Gly

КЛИНИЧЕСКOЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРАПЕПТИДА Ala-Glu-Asp-Gly (AGAG).

ТЕТРАПЕПТИД Ala-Glu-Asp-Gly ИНДУЦИРУЕТ ТЕЛОМЕРАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ И ЭЛОНГАЦИЮ ТЕЛОМЕР В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

В.Х.Хавинсон, И.Э.Бондарев, А.А.Бутюгoв.
Санкт-Петербургский институт биорегуляцuu геронтологии СЗО РАМН.

Добавление пептида (тетрапептид Ala-Gly-Asp-Gly)  в культуру фетальныx фибробластов человека, нега­тивных по теломеразе, индуцирует экспрессию каталитической субъединицы, фермента­тивную активность теломеразы и удлинение теломер, что, вероятно, связано с реактивацией гена теломеразы в соматических клетках и свидетельствует о возможности уве­личения длительности жизни клеточной популяции и организма целом.

Ключевые слова: пептид, Ala-Glu-Asp-Gly, тетрапептид, теломераза, теломеры, фuбробласты 



Тетрапептид (Ala-Glu-Asp-Gly) сконструи­рован и синтезирован на основе анализа амино­кислотного состава комnлекеноrо пептидного препарата эпиталамина, вьделенноro из эпифиза мозга животрых [10]. Установлено, что тетрапептид восстанавливает нарушенную нейроэндок­ринную регуляцию у старых обезьян [11], ин­дуцирует активацию рибосомальных генов [1]. Также обнаружено, что добавление тетрапептида в культуру лимфоцитов, выделенных от людей пожилого и старческого возраста, способствует деконденсации перицентрометрического гетеро­хроматина и активации генов, репрессированных вследствие зависимой от возраста конденсации эухроматиновых регионов хромосом [3]. Эпита­лон способствует увеличению средней продол­жительности жизни мышей и крыс снижает частоту хромосомных аберраций у ускоренно стареющих мышей SAМ [2,4]. Следует отмeтить, что тетрапептид увеличивает среднюю макси­ MaльHyю продолжительность жизни без разви­тия злокачественных новообразований у этих животных [4-6]. Теломеразная теория старения связывает возрастное снижение пролифератив­ного потенциала тканей с критическим укорочением теломер в процессе клеточного деления [15]. Теломераза представляет собой рибонуклеи­новый фермент, достраивающий потерянные из­ за асимметрии в синтезе лидирующей и отстаю­щей цепей днк теломерные повторы TАGGG [13] и кодируется двумя генами - для РНК- компонента и белкового компонента фермента [9]. У человека экспрессия белкового компонен­та теломеразы и соответствующая ферментатив­ная активность наблюдается в большинстве зло­качественных, половых, ранних эмбриональных и, возможно, стволовых клетках. Соматческие клетки человека теломеразной активности лише­ны [12]. В настоящей работе было исследовано влияние тетрапептида на экспрессию каталитичес­кой субъединицы теломеразы, активность тело­меразы и удлинение теломер в соматических клетках человека. 

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ:

Культура положительной по теломеразе клеточ­ной линии HeLa [9] и первичная культура че­ловеческих фетальных легочных фибробластов 602/17 (24 нед) была получена из лаборатории клеточных культур НИИ гриппа РАМН. Клет­ки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамина, 100 МКГ/МЛ гентамицина сульфата. Фетальные фибробласты, начи­ная с 27-го пассажа, обрабатывали тетрапептидом концентрации 0.05 МКГ/МЛ в течение 4 cyток и анализировали. 

Для детекции экспрессии белковой ката­литической субъединицы теломеразы феталь­ные фибробласты помещали на стерильные пред­метные стекла ("Menzel-Glaser"). Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли мы­шиными моноклональными антителами к ка­талитической субъединице человеческой теломеразы NCL-hТЕRТ ("Novocastra Laboratories Ltd. "). В качестве вторичных антител исполь­зовали универсальный пероксидaзный набор АВС ("Dako"). Окрашивание препаратов проводили в соответствии инструкциями к наборам указан­ных реактивов. Микроскопию осуществляли на аппарате "Nikon Eclipse Е400" цифровой ка­мерой "AST1".

Энзимаmческую активность теломеразы оп­ределяли по протоколу амплификации теломер­ных повторов (TRAP) [9]. 10в6 Клеток отмывали холодным забуференным фосфатами физиолоrn­ ческим раствором (ЗФР) и лизировали 100 мкл холодного СНАРS-буфера, в котором в 10% гли­церине содержалось 10 мМ трис-НСI, рН 7.5, 1 мМ MgCl" 1 мМ ЭПА, 0.5% CHAPS, 0.1 мМ ФМСФ, 5 мМ 2-меркanтоэтанола, на льду в те­чение 30 мин. Экстракты центрифyгиpовали при 12 000 об/мин течение 30 мин при с. Су­пернатанты переносили в пробирки и хранили при -70 с. для анализа теломеразной активности in vitro 2 мкл супернатанта добавляли 46 мкл однократного Таq-буфера, содержащего 2 мкМ ТS-праймера (5'-А

АТ CCG TCGAGC AGA GП­ 3'), 50 мкМ dNTPs и инкубировали при 30 течение 30 мин. Затем добавляли 2 мкМ сх­ праймера (5'-ССС ПА ССС ПА ССС ПА ССС ПА -3'), 5 вц Тaq-ДНК полимеразы ("Promega") проводили 35 циклов ПЦР с параметрами; 94"С - 1 мин, 50"С - 1 мин, 72 - 1.5 мин на термоциклере с нагревающейся крышкой "DNA Engine РТС-200" ("М] Research"). Продукты пцр электрофоретически разделяли в 10% не­ денатурирующем полиакриламидном геле, ок- 693 окрашивали с помощью "SYВR Осееп" ("Molecular Probes") и визуализировали в ультрафиолето­вом свете. 

Среднюю длину теломер в индивидуальных клетках измеряли методом флкюресцентной гиб­ ридизации in situ с проточной цитофлюоримет­рией (flow-FISH) [14]. для этого клетки дваж­ды отмывали в ЗФР, содержащем 0.2% БСА, ресуспендировали в растворе для гибридизации, содержащем 70% формамида, 1.0% БСА, 20 мМ трис-НС1 рН 7.0 ("Sigma") и 0.3 мкг/мл специ­фичной для теломер СзТ~ пептидно-нуклеиновой кислотной (ПНК) пробы, меченной ФИТЦ ("PerSeptive Biosystems"). Образцы подвергали тепловой денатурации при 80"С в течение 10 мин и последующей гибридизацией при комнат­ной температуре в темноте течение 2 ч. За­тем суспензию клеток цеmpифугировали, сynер­ натанты удаляли, а клетки дважды отмывали буферном растворе, содержащем 70% формами­ да, 10 мМ трис-НС1 рН 7.0, 0.1% БСА, 0.1% твин-20 ("Sigma") и один раз в ЗФР, содержа­щем 0.1% БСА, 0.1% твин-20. После отмывания клетки ресуспендировали в ЗФР, содержащем 0.1% БСА, 10 мкr/мл РНКазы А ("Sigma"), 0.06 мкг/мл йодида пропидия ("Sigma") и инкубиро­вали при комнатной температуре в темноте те­ чение 2 ч. Контрольную гибридизацию без ПНК осуществляли для выявления фоновой авто- флюоресuенции для расчета спеuифичной для теломер флюоресценции в условных единицах. 10в4 Клеток анализировали методом проточной цитофлюориметрии на приборе "FACSCAN" ("Beckton-Dickenson"). 

Статистическую обработку данных осуществ­ляли с помощью программного обеспечения "CellQuest" "XnView1.17". Достоверность различий между вариантами оценивали с помощью t критерия Стьюдента.


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Имуногистохимическое исследование показало инпенсивное ядерное окрашивание клеток поло­жителъной по теломеразе линии НеLз (рис. 1, а), использованных качестве положительноro контроля, также обработанных тетрапептидам фeтaльных фибpoбластов (рис. 1, 6). В интактных (контрольныз) фетальных фибробластах подобного окрашивания не обнаружено. 

В интактных феталъных фибробластах так же не обнаружено теломеразной активности,в то время как такая активность выявлена в клетках HeLa и фибробластах, обработанных тетрапептидом (рис. 2).

Фякюресuентная гибридизarrnя in situ про­ точной шпофлюориметрией продемонстрирова­ла увеличение средней максимальной длины те­ломep фазе G1 клеточноro цикла в фетальных фибробластах, обработанных Эnитaлоном, по сравнению с контрольными клетками (рис. 3). Средняя длина теломер фазе G I клеточного цикла в контpoле составила 180 усл. ед. Добавление тетрапептида привело к увеличению средней длины теломер до 240 усл. ед. (р<0.О5). 

Результаты проведенного эксперимента по­казали, что тетрапептид соматических клетках человека может индуцировать экспрессию энзи­матическоro компонента теломеразы, теломepaзную мактивность и удлинение теломер, которoe в среднем составило 33.3%. Таким образом, в нашем эксперименте впервые установлена ин­дукция теломеразной активности пептидом. Эти данные значительной мере способствуют по­ниманию геропротекторных эффектов тетрапептида в различных экспериментальных моделях. Известно, что критически короткие теломеры не способны предотвращать слияние хромосом, что может привести к активации протоонкогенов и малигнизации клетки.

Активация теломера­зы и удлинение теломер под действием пепти­да объясняет один из механизмов противоопу­холевого действия тетрапептида старых животных. 



ЛИТЕРАТУРА 1. Mиcuмoв с.В., Бохелер к.п., Хавинсон в.х., Аниси­ мов В.n. // Бюл. экспер. биал. 2002. Т. 133, :N2 3. с. 340-347. 2. Розенфмьд с.в., Того Е.Ф., Михеев В.С. др. //Там .же. С. 320-322. 695 3. Ха8инсон В.Х, Лежава Т-А., Монаселuдзе Дж.г. др. // Там же. N! 10. С. 451-455. 4. Anisiтov УМ, Кhavin.ron yКh., MikhahkiAl, YasЫnA.I. // МесЬ. Лging Dev. 2001. Vol. 122. Р.41-68. 5. Anisimov v.N., Khavinson V.Kh., Popovich 1. G., Zabez/linski М.А. //Cancer Lett. 2002. Уа!. 183. Р. 1-8. 6. .AnШmov УНО, Кhavinson V.Кh., Provinciali М. е! 0/. // Int. J. Cancer. 2002. Уа!. 101. Р. 7-10. 7. EJmоге L. W, Но/! S.E. / / Моl. Carcinog. 2000. УО!. 28, N 1. Р. 1-4. 8. Реng J., Funk WD., Wang S.S. е! 0/. // Science. 1995. Val. 269, N 5228. Р. 1236-1241. 9. Нiyama Е., Нiyama к., Yokoyama Т. etal. / /Nat. Med. 1995. Уа!. !. Р. 249-255. 10. Юuwinsоn V.Кh.//Neuraendacrino!. Lett. 2002. Уоl. 23, Supp!. 3. Р. 11-144. 11. Кhavinson v., (ioncharova Но, Lapin В.// Ibid. 2001. Уаl. 22. Р. 251-254. 12. Meyer.s'on м., Counter с., Баtоn E.N. // СеН. 1997. Уаl. 90, N 4. Р. 785-795. 13. Moгin G.B. // Cell. 1989. Vol. 59. N 3. Р. 521-529. 14. Rufer Но, Dragowska W, ТhоmЬшу G. е! al. // Nat. Biotechnal. 1998. Уаl. 16, N 8. Р. 743-747. 15. Wright W.E., Shay J. W // Nat. Вiotechnol. 2002. уо]. 20, N 7. Р. 682-688. Получено 24.04.03

Jan 27, 2017 Клинические исследования